PCR法を用いた3次元スクリーニング

試薬
  1. Tos17末端Primer 1st Screening用
    T17F-1ACCACTTCAGAGATTGTGTGGTTGC
    T17R-1CAGCAACGATGTAGATGGTCAAGC
  2. Nested PCR用
    T17F-2GACAACACCGGAGCTATACAAATCG
    T17R-2AGGAGGTTGCTTAGCAGTGAAACG
    T17LTRN6FCTGTATAGTTGGCCCATGTCC
    T17LTR7RATGGACTGGACATCCGATGG
  3. Taq polymerase (Expand Long Template PCR System, Boehringer-Mannheim, 3.5 uni t/μl)
方法
  1. PCR
    鋳型DNA (10ng/μl)5 μl
    10 x PCRバッファー2 μl
    2mM dNTP2 μl
    2.5 mM MgCl22 μl
    10 μM Tos17プライマー2 μl
    10 μM 任意プライマー2 μl
    Taq pol0.5 μl
    +DW to20 μl
  2. 94℃, 3分
  3. 以下のステップを10サイクル行う。
    94℃30秒
    62℃30秒
    68℃2分
  4. 次に以下のステップを20サイクル行う。
    94℃30秒
    62℃30秒
    68℃2分(各サイクルにつき、20秒伸長サイクルを追加)
  5. 68℃, 10分
  6. 1%アガロースゲル電気泳動で解析する。増えが悪い場合は、 LA-TaqでPCRを行う。
  7. 目的の遺伝子のさらに内側の塩基配列で作製したプライマーを用いて、 最初の反応溶液の20倍希釈溶液1μlを鋳型にして再度PCR(final 20 μl) を行う。1st PCRでT17F-1を用いた場合は、T17F-2とT17LTRN6Fを用いた2 種類の反応を行う。T17R-1を用いた場合は、同様に2種類のRプライマーを 使用する。これらのプライマーセットを用いるとサイズが異なる産物が得 られるので、正しい増幅産物であるかどうかの確認できる。
  8. サザン解析で増幅バンドが目的の遺伝子由来であることを確認する。
宮尾安藝雄、廣近洋彦、「イネのTos17による遺伝子破壊法」、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ14、植物のゲノム研究プロトコール 最新のゲノム情報とその利用法、秀潤社、P.73-81、(2001).
お問い合わせは、ゲノム動態研究室 廣近 (hirohiko@abr.affrc.go.jp)、宮尾 (miyao@affrc.go.jp)まで
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