スモールスケールCTAB法

1. 1.5 x CTAB液

   Cetyl trimethyl ammonium bromide	10	g
   1 M Tris-HCl, pH8.0	50	ml
   0.5 M EDTA	20	ml
   NaCl	41	g
   ポリビニルピロリドン	5	g
   H2O (fill up)	750	ml

2. 沈澱Buffer

   Cetyl trimethyl ammonium bromide	10	g
   1 M Tris-HCl, pH8.0	50	ml
   0.5 M EDTA	20	ml
   H2O (fill up)	1000	ml

3. 1M NaCl-TE

   NaCl	58.4	g
   1 M Tris-HCl, pH8.0	10	ml
   0.5 M EDTA	2	ml
   H2O (fill up)	1000	ml

4. クロロホルム
5. エタノール
6. TE (1 μg/ml RNase)

1. イネの葉1枚程度を液体窒素で凍らせて、乳鉢で粉末にする。
2. 0.7 mlの1.5x CTAB液の入ったエッペンドルフチューブにスパチュラを使って移す。(移す分量は、チューブを転倒すると懸濁液がゆるやかに移動する程度)
3. 0.5 mlのクロロホルムを加えて、室温で20分程度振とうする。
4. 14,000 rpmで5分遠心する。
5. 上清0.5 mlを新しいチューブに移し、0.5 mlの沈澱バッファーを加えて混合する。
6. 55℃のウォーターバスに30分程度置く。(沈澱が析出する)
7. 14,000 rpmで5分遠心する。
8. 上清を完全に除き、1M NaCl-TEを0.5 ml加える。
9. 55℃のウォーターバスに2時間程度置き、時々チューブを転倒混和し て沈澱を溶かす。
10. DNAが完全に溶けたら、14,000 rpmで5分遠心して不溶物を沈澱させる。
11. 上清を新しいチューブに移し、1 mlのエタノールを加えて、よく混合する。
12. 14,000 rpmで5分遠心する。
13. 上清を捨て、1 mlの70%エタノールを加えて沈澱と管壁をリンスする。
14. 14,000 rpmで2分遠心する。
15. 上清を捨てる。
16. もう一度軽く遠心して残ったエタノールを底に集め、ピペットマンを用いて残ったエタノールを完全に除去する。
17. 10分程度風乾して白かった沈澱が透明になったら、50 μlの TE(+RNase)に溶かす。(溶けにくいので、溶けるまで根気強く撹拌する。)
18. 2 μlサンプリングして、蛍光光度計で濃度を測る。
19. 50 ng/μlにTEで希釈して-20℃保存。加えるTEの量 = (濃度 ng/50) * 48 - 48